NO.0_採用乙醯膽鹼酯酶(AChE)抑制率設計的農藥殘留快速檢驗技術概述(生化法)

大家好~我是STY小野人~

台灣屬於海島型國家,四面環海,在這樣孤立的環境下從事研發工作確實一不小心就會變成上述故事中的野人,所以STY小野人所屬的漢翊公司從一開始投入食品安全快速檢驗技術的研發就積極與其他國家研究單位進行交流,避免讓STY小野人也淪為野人獻曝故事中的主人公。

今天STY小野人要分享的是生化法農藥殘留快速檢驗技術概述,就有容我來個野人獻曝,跟國人一起分享這項成熟技術,避免因為錯誤或封閉的資訊而造成我們大家一起變成故事中的主人公。

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生化法農藥殘留快速檢驗技術概述

研究摘要

 

一、有機磷與胺基甲酸鹽類農藥神經毒害機制

有機磷與胺基甲酸鹽類農藥產生神經毒性的作用已相當明確,抑制體內乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase, AChE)是其產生神經毒害的主要機制,屬於膽鹼酯酶抑制物(cholinesterase inhibitor)。 乙醯膽鹼(acetylcholine, ACh)是動物體內的神經傳導物質(neurotransmitter)的一種,存在於副交感神經節後神經元、交感與副交感神經節前神經元、骨骼肌肌肉神經交接點、中樞神經系統等處,並做為神經細胞在突觸(synapses)之間神經脈衝傳遞的化學物質(圖一A)。當前突觸端(pre-synaptic terminal)接受神經脈衝的刺激時,便將乙醯膽鹼釋出。此化合物接著進入後突觸端(post-synaptic terminal)與似蕈鹼(muscarinic)或似菸鹼(nicotinic)受體(receptor)接合,並再產生另一脈衝,而乙醯膽鹼則被乙醯膽鹼酯酶水解為乙酸(acetate)與膽鹼素(choline)(圖一B)。而有機磷及氨基甲酸鹽類殺蟲劑可與乙醯膽鹼酯酶接合,並使其失去水解乙醯膽鹼的作用,而使後突觸端持續的接受乙醯膽鹼的刺激,並不斷地產生神經脈衝,此也造成所相對應的生理作用不停的發生,而形成神經毒害作用(圖一C)。

(*坊間有一些對於生物學或神經科學一知半解的單位或廠商宣稱乙醯膽鹼(acetylcholine, ACh)或乙醯膽鹼酯酶(acetylcholinesterase, AChE)僅存在動物腦部,主要是誤以為神經系統只存在動物腦部,但其實是錯誤的觀念。)

但是上述結合(抑制作用),除了少數幾個品項的有機磷劑會形成穩固的結構,而造成乙醯膽鹼酯酶發生不可逆之老化作用外(圖二中的4),大多數的接合是屬於可逆性反應(圖二中的1),而就算產生離去基(Leaving Group)的情況(圖二中的2),也可透過水解作用恢復乙醯膽鹼酯酶之活性(圖二中的3),並非坊間少數對農藥殘留快速檢驗技術一知半解檢驗儀器銷售業者宣稱的不可逆結合,而小野人認為只有徹底了解有機磷與胺基甲酸鹽類農藥產生神經毒性的作用機制,才能設計出一套完善的農藥殘留快速檢驗技術,讓民眾真的能簡單且準確的保護自己食的安全。

二、農藥殘毒快速檢驗技術之基本檢驗原理

1、檢驗原理及方法:基於有機磷與胺基甲酸鹽類農藥明確的為乙醯膽鹼酯酶之抑制物質而設計出的一種農藥殘留檢驗技術,屬於一種總毒性結果論的分析技術,利用的是生物化學方法搭配光學檢驗方法一起實現檢驗流程,主要原理即利用純化自對特定農藥敏感之動物腦部之乙醯膽鹼酯酶(AChE),針對其活性及受外來物抑制之程度作檢定。

2、相關試劑及檢驗流程:檢驗過程先將受檢樣本萃取,以磷酸鈉溶液作為緩衝液,加入乙醯膽鹼酯酶(AChE),再使用二硫代二硝基甲酸(DTNB)溶液作為呈色劑,最後再以碘化硫代乙醯膽鹼(ATCL)溶液作為反應基質,使受檢樣本液進行呈色反應,接著採用食品安全速測儀或是農藥殘留快速檢驗儀分析受驗樣品於412nm波長下吸光值的變化量(抑制率),來分析蔬果樣品中是否含胺基甲酸鹽殺蟲劑或有機磷殺蟲劑之殘留。

【抑制率(%)=(對照組的吸光值-樣品的吸光值)÷對照組的吸光值×100】

3、由於是針對乙醯膽鹼酯酶之活性受到氨基甲酸鹽或有機磷劑類農藥等物質抑制程度而做之檢驗,當使用小野人公司之常溫保存型AChE酵素試劑時之抑制率的總毒容許值為50%(*不同酵素之容許值皆不同),大於容許值時為強陽性,當樣本呈現強陽性結果,則需要進行複驗,確認是否為人為操作不當所造成。而經複驗確認為樣本仍為陽性結果時,建議送交衛生主管單位或認證實驗室使用法定檢驗方法確定樣本中殘留之農藥品項和含量,或是樣本自身含有天然抑制物。

4、其實當抑制率高於0即表示有抑制物存在,也就是抑制率就算只有0.001都可以合理懷疑可能有氨基甲酸鹽或有機磷劑類農藥等抑制物存在於樣本當中。但由於農藥快篩的實驗環境大多不是在標準的實驗室中實施,操作人員往往也只是受過極短時間訓練的農民、學校教職員或一般民眾,因此會有較大的實驗誤差值產生。所以,當在普通環境下使用小野人公司之常溫保存型AChE酵素試劑時之抑制率誤差值設定為15,也就是在抑制率大於15開始,便可以合理懷疑有氨基甲酸鹽或有機磷劑類農藥等抑制物存在於樣本當中,也就是抑制率介於15~40時,樣本中應有氨基甲酸鹽或有機磷劑類農藥殘留,只是總毒性不高,屬微量殘留。又當抑制率介於40~50時,此時抑制率已經偏高,建議應當進行複驗,藉以確定是否因為採樣不當等因素,造成低估或高估樣本中農藥之殘留量。

三、是否該使用強氧化物溴來進行附加實驗

小野人經過研究比對(請參考:NO.4_有機磷類農藥氧化後毒性變化研究)得到關於採用乙醯膽鹼酯酶抑制率設計的農藥殘留快速檢驗技術添加溴或溴水與否後,可偵測農藥之結果如下:

1、不添加溴或溴水時:可以檢測「有機磷」、「硫代有機磷」、「胺基甲酸鹽」等類型之農藥殘留總毒性抑制率。

2、添加溴或溴水時:可以凸顯一部分因為氧化作用而轉化成劇毒農藥的「硫代有機磷類農藥中的一部分品項」之抑制率,但前提必須是農產品等樣本中之有機磷及胺基甲酸鹽等類型農藥沒有殘留或低劑量殘留,且殘留之硫代有機磷農藥屬於會因氧化而增毒的品項,否則將會造成添加溴水與否的二個實驗之抑制率因對照基準不明確而無從比較,造成無效實驗。

3、無效實驗實例:由於設計了添加強氧化劑溴或溴水的單位或廠商,說明了添加溴或溴水便可以使農藥快篩技術更有效的辨識出有機磷農藥,但這樣片面的見解小野人無法認同,其實這方法有很大的實驗盲點及變數,以下簡單舉一些無效實驗的實例讓各位參考。

*例一:假設待測樣本僅含高劑量會因氧化破壞結構減毒之強毒性有機磷農藥(例:美文松)殘留時,此時沒有添加溴水時抑制率為75。但添加溴水破壞了強毒性有機磷類農藥之結構後,使其產生減毒現象造成抑制率降為40,此時添加溴水也無法說明待測樣本中存在有機磷農藥殘留,反而可能因為抑制率減低,而將有機磷農藥誤判為胺基甲酸鹽類農藥,也就無法達到該方法預期增加檢出有機磷類農藥之目的,造成沒有意義的實驗產生。

*例二:假設待測樣本同時含低劑量會因氧化破壞結構減毒之強毒性有機磷(例:美文松)及低劑量不受氧化作用影響之胺基甲酸鹽等類型農藥時,此時沒有添加溴水時抑制率為45。但添加溴水破壞了強毒性有機磷類農藥之結構後,使其產生減毒現象造成抑制率降為25,此時添加溴水反而無法說明待測樣本中存在有機磷農藥殘留,反而可能因為抑制率減低,而將有機磷農藥誤判為胺基甲酸鹽類農藥,甚至可能造成低估了農藥殘留狀態,當然也就無法達到該方法預期增加檢出有機磷類農藥之目的,造成沒有意義的實驗產生。

*例三:假設待測樣本同時含高劑量會因氧化破壞結構減毒之有機磷或胺基甲酸鹽類農藥及低劑量會因氧化增毒之硫代有機磷類農藥(例:陶斯松)殘留時,此時沒有添加溴水時抑制率為80。但添加溴水後,雖然因氧化增毒了硫代有機磷類農藥,但同時也破壞了有機磷或胺基甲酸鹽類農藥結構而造成減毒現象,因此抑制率還是80,此時無法說明添加溴水前後的差異性,也就無法達到該方法預期增加檢出有機磷類農藥之目的,造成沒有意義的實驗產生。

*例四:假設待測樣本同時含高劑量之有機磷、硫代有機磷、胺基甲酸鹽等類型農藥時,此時沒有添加溴水時抑制率為100。但添加溴水後,不管增毒或是減毒作用,因為總毒性依然很高,所以抑制率還是100,此時無法說明添加溴水前後的差異性,也就無法達到該方法預期增加檢出有機磷類農藥之目的,造成沒有意義的實驗產生。

由上述實例可知,由於添加強氧化劑增毒但無效的實驗狀態廣泛的存在,這將使得添加溴或溴水來增毒的實際應用範圍被侷限在待測樣本中僅含有極微量硫代有機磷農藥殘留狀況發生時,亦或是特別想要篩檢出一部分因為氧化作用而轉化成劇毒農藥的「硫代有機磷類農藥中的一部分品項」也可以運用這項附加實驗。

然而,農藥殘留快速檢驗技術設計的用意是在第一時間用最便利且安全的方法阻卻有高度農藥殘留危害之蔬果輸出,而微量分析或單品項定性定量這個部分本來也不是測定乙醯膽鹼酯酶(AChE)抑制率可以做到的範圍,加上現地檢驗時根本全然不知道待測樣本農藥殘留之品項,當下也就只能進行農藥殘留總毒性測試,而基於有機磷與胺基甲酸鹽類農藥明確的為乙醯膽鹼酯酶之抑制物質而設計出的農藥殘留檢驗技術在不添加強氧化劑時,便可以檢驗出「有機磷」、「硫代有機磷」、「胺基甲酸鹽」等類型之農藥殘留總毒性,此時應該要研究改良的應該是酵素試劑常溫下的穩定性、樣本萃取辦法的強化及精簡測試流程,藉以有效提升檢測成功率,有效攔阻總毒性超標之待測樣本流出市面,而非鑽研開發一些華麗但不太實用的附加實驗流程。不過,本來如果附加實驗沒有太大的風險又能有效提升辨識率,採用來增加對照比較,倒也無妨。但此附加實驗必須使用具揮發毒性的強氧化劑溴,反應後的產物更可能是強急毒性逼近沙林毒氣的有毒物質,加上這些毒性化學物質又常具有累積毒性,縱使微量,但採用農藥快速檢驗技術的單位往往必須頻繁進行檢驗作業,有毒物質經年累月的在檢驗操作人員體內不斷累積,恐怕也是一個影響健康的危害因素,而且最重要的目的提升有機磷類農藥辨識效果也不明確。基於此,小野人暫時還是建議BOSS不把添加各種強氧化劑增毒作為小野人公司農藥快速檢驗技術的主要實驗或附加實驗選項。